Penicillinen zijn dodelijk voor de zich vermeerderende bacterie. Wanneer een bacteriecel zich wil vermeerderen groeit de cel, om zich vervolgens in twee identieke cellen te splitsen. Om deze groei mogelijk te maken, wordt extra celwand aangemaakt. Penicillinen en andere beta-lactamen, zoals cephalosporinen, verstoren deze aanmaak van nieuwe celwand. Penicillinen zijn daardoor alléén werkzaam in bacteriën die zich aan het vermeerderen zijn en hiertoe celwand aanmaken.

De celwand van bacteriën is opgebouwd uit een soort skelet van peptidoglycanen.
Peptidoglycanen zijn grote moleculen, bestaande uit lange staafvormige suikerverbindingen (di-sachariden) met dwarsverbindingen van eiwitketens (polypeptiden), die een soort verstevigend traliewerk rond de bacterie vormen, zie figuur. Samen met andere verbindingen vormen peptidoglycanen de celwand.

Het petidoglycaanskelet in de celwand van bacteriën De geelgekleurde staafvormige suikerverbindingen (het glycaangedeelte) vormen met eiwitketens (het peptidegedeelte) de blauwgekleurde dwarsverbindingen. In de celwand van zgn. gram-negatieve bacteriesoorten vormen deze moleculen één laag, in de celwand van zgn. gram-positieve bacteriesoorten vormen deze moleculen meerdere (tot 50) lagen.

De bouw van het penicillinemolecuul lijkt zeer veel op het D-alanil-D-alanine einde van het peptidoglycaanskelet in de bacteriecelwand, zie figuur.

Eindstuk van het peptidoglycaan (links) en het penicillinemolecuul (rechts) De verschillen zijn dat bij het D-alanil-D-alanine de ß-lactamring en de 5-ring ontbreken en aan het penicillinemolecuul geen peptidoglycaanskelet vast zit.

Penicilline doet haar werking tijdens de laatste fase van de vorming van de celwand, gedurende de vorming van de kruisverbinding tussen de suiker- en eiwitketens. De kruisverbinding wordt gelegd door transpeptidase-enzymen. In plaats van met het peptidoglycaan verbindt het enzym D-analine-transpeptidase zich met het penicillinemolecuul, zie figuur. Doordat aan het penicillinemolecuul niet de skeletstructuur zit die nodig is om de celwand te maken, wordt de aanmaak van celwand gestopt.

Binding van het penicillinemolekuul aan het enzym van de bacterie

Bacteriën hebben een hoge inwendige (osmotische) druk. Door de aanmaak van celwand in een groeiende en delende bacterie te verstoren weerstaat de bacterie deze druk niet en barst de cel open en loopt leeg (lyseert).